MFFMS: 생체 분자의 양자 스핀 효과에 대한 고감도 검출

 형광 미세 분광법은 살아있는 세포의 생물학적 과정의 메커니즘을 밝혀내는 강력한 도구로 입증되었습니다. 그러나 이러한 생물학적 반응에 대한 양자 효과를 검색할 때 현재 사용 가능한 기술과 기기는 복잡한 소음 환경에서 낮은 농도의 미묘한 양자 상호작용을 포착하는 데 필요한 감도나 특이성을 제공하지 못할 수 있습니다.

여기에서는 생물학적 시스템에서 스핀 상관 라디칼 쌍의 양자 거동을 모니터링하기 위해 맞춤형으로 제작된 자기 형광 변동 미세 분광법(MFFMS)이라는 미세 분광기를 소개합니다1. 단일 광자 애벌런치 다이오드(SPAD)와 전자 증식 전하 결합 장치(EMCCD, Andor iXon Ultra 888) 카메라 형태의 최근 발전된 형광 검출 기술을 활용하여 외부 자기장으로 인한 형광 신호의 미세한 변화를 모니터링할 수 있었습니다. 또한 사후 디지털 잠금 증폭기(DLIA) 데이터 분석을 통해 EMCCD 이미지에서 자기에 민감하지 않은 형광을 제거할 수 있었습니다.

Setup

옵틱테이블 현미경 배열(그림 1)에는 공초점 배열에 높은 조리개 대물 렌즈(물 또는 오일 침지, 올림푸스)가 포함되어 있습니다. 샘플은 연속파(CW) 다이오드 레이저(Thorlabs) 또는 초음속 소스-음향-광학 조정 가능 필터 조합(SC-AOTF, YSL)에 의해 450nm에서 여기됩니다. 형광은 이색 거울(DM, Semrock) 및 대역 통과 필터(BP, Semrock) 배열을 통해 스펙트럼 필터링된 후 피에조 거울(M2, Newport)을 통해 하나 또는 두 개의 SPAD(마이크로 광자 장치) 또는 (플립 미러, FM 포함) EMCCD(Andor iXon Ultra 888) 카메라로 향하게 됩니다. SPAD는 비편광 또는 편광 형광을 모니터링하도록 배치되며, 이는 각각 DM과 편광 빔 스플리터(PBS, Thorlabs)를 전환하여 쉽게 달성할 수 있으며 재조정이 필요하지 않습니다. 편광 형광 실험의 경우, 편광 유지 단일 모드 광섬유(PSM, Thorlabs)에 들어가기 전에 편광 여기 빔의 각도를 회전시키기 위해 전동 반파판(λ/2, Thorlabs)을 사용합니다. 샘플 주위에 위치한 수냉식 헬름홀츠 코일(자체 제작)을 통해 외부 자기장(10mT, 20ms 상승 시간)이 적용됩니다. 자기장은 테슬라미터(Lake Shore F71)로 모니터링됩니다. 샘플은 3D 스테퍼 모터/피에조 스테이지(Thorlabs)에 위치한 흐름 채널 슬라이드(μ-Slide I0.2 Luer, ibidi)에 보관됩니다. 시료 흐름은 프로그래밍 가능한 미세 유체 주사기 펌프(Harvard Apparatus)를 통해 이루어집니다. 수집 소프트웨어는 LabVIEW로 작성되었습니다. 모든 데이터는 MATLAB 또는 Python으로 처리되었습니다.

Figure 1: Schematic of the electrical and optical components of the microspectroscope. Details are described in the main text. Abbreviations (in alphabetical order): AOTF is an acousto-optic tuneable filter; BP1 and BP2 are band-pass filters; C1 and C2 are magnetic coils; CL is the collimating lens; C/T is the counter/timer unit; DG is the delay generator; DL is the diode laser; DM1 and DM2 are dichroic mirrors; EMCCD is the electron-multiplying charge-coupled device camera; FC is the fibre coupler; FL1 and FL2 are focusing lenses; FM is a flip mirror; FS is the flow slide; FW is the filter wheel;  λ/2 is a half-wave plate; M1 and M2 are mirrors; MS is a motorised shutter; OL is the objective lens; PBS is a polarising beam splitter cube; PC is the personal computer; PH is the pinhole; (P)SM is the (polarisation maintaining) single-mode fibre; PSU is the power supply unit; SC is the supercontinuum source; SP is the syringe pump; SPAD are the single-photon avalanche diode detectors; VND is the variable neutral density filter.

Results

SPAD 탐지 결과에 대한 자세한 내용은 해당 게시물을 참조하세요. 여기서는 EMCCD 탐지와 DLIA 분석에 중점을 두겠습니다. 그림 2a는 사용된 트리거 체계를 보여줍니다. 카메라의 TTL 출력은 헬름홀츠 코일의 전원 공급 장치와 기계식 셔터를 제어하기 위한 마스터 트리거로 사용됩니다. 여기에서는 여기 빔을 통해 유입된 HEWL-FMN에 대한 CW 여기 실험을 시연합니다. 그림 2b에 표시된 서프 플롯은 시간에 따른 모든 픽셀의 MFE를 보여줍니다. 형광 강도는 100μL/min-1의 유속에서 시간이 지남에 따라 증가하다가 평형 수준에 도달합니다. 광표백으로 인해 강도가 감소하는 정적 샘플에서는 그 반대가 관찰됩니다. 플라빈 형광은 28분 동안 16,800 프레임을 획득하는 100ms의 프레임 속도로 기록되었고, 자기장은 0.25Hz에서 50% 듀티 사이클로 변조되었습니다. 그림 2b의 삽입물은 20프레임마다의 평균을 보여 주며, 신호 대 잡음비가 우수한 선명한 MFE(-0.6%)를 보여줍니다.

그러나 이 접근 방식은 외부 자기장에 대한 라디칼 쌍의 반응 시간을 숨기고 모든 시간 단계를 분석해야 합니다(그림 2c). 약한 형광 신호는 종종 잡음이 많은 환경(예: 세포)에 의해 가려질 수 있으며, 이는 해당 신호에서 0~1%의 자기장 유발 변화를 측정할 때 거의 불가능할 수 있습니다.  이러한 자기 민감 신호를 추출하기 위한 접근 방식은 락인 탐지2,3를 사용하는 것입니다. 여기에서는 적용된 자기장의 주파수(2초 동안 켜짐, 2초 동안 꺼짐, 따라서 0.25Hz)에서 형광 신호를 추출하는 사후 디지털 록인 증폭기(DLIA) 접근 방식을 시연합니다. DLIA 분석은 -1.37%의 절대 MFE를 생성하며, 이는 원시 데이터에서 계산된 MFE인 -0.6%보다 높은 수치입니다.

DLIA 분석의 주요 작동 원리는 다음과 같습니다. 복잡한 파형의 푸리에 분석은 다양한 진폭과 위상 관계의 사인파(및 코사인파)로 구성하거나 분해할 수 있습니다. 구형파는 기본 사인파(구형파와 동일한 주파수의 사인파)와 기본의 홀수 고조파로 구성됩니다. 고조파의 진폭은 1/N과 같으며, 여기서 N은 고조파(1, 3, 5, ...)입니다. 각 고조파는 기본 고조파와 동일한 위상 관계를 갖습니다. DLIA 검출 형광 신호의 고속 푸리에 변환(FFT)에서 얻은 첫 13개의 고조파 성분으로부터 구형파를 구성하면 역고속 푸리에 변환(IFFT)을 거친 후 자기장 온-오프 실험에 대한 구형파 모양을 얻을 수 있습니다(그림 2c). 평균 IFFT에 대한 단일 지수 적합은 HEWL-FMN 라디칼 쌍의 자기장 응답 시간(200ms)의 상승(krise = 4.76 ± 0.98 s-1) 및 감쇠(kdecay = 5.08 ± 0.95 s-1)를 제공합니다. 이 원리 증명 접근법은 약한 형광 신호에 대한 미세한 자기장 유도 변화를 새롭고 정밀하게 분석할 수 있습니다.

Figure 2: Magnetic field effects (MFEs) and digital lock-in detection with EMCCD detection. a, Schematic of the trigger, where the EMCCD is the master trigger (100 ms) that controls the magnetic coil power supply (2 s on, 2 s off) and the pump beam shutter (CW). b, EMCCD-detected MFE on FMN (2 μM) and HEWL (0.5 mM). Fluorescence was monitored between 500 nm and 600 nm at a flow rate of 100 μL min−1, with 16,800 frames over 30 min. c, Methodology for the analysis of the DLIA. The raw data passes through a high-pass filter (HPF, 0.2 Hz) and 10th order median filter (MF) to obtain the DLIA data. The DLIA data then goes through an FFT and IFFT to acquire the rise (krise = 4.76 ± 0.98 s−1) and decay (kdecay = 5.08 ± 0.95 s−1) of the MFE, which has a 200 ms response time. Data are presented as mean values ± s.d. in b.

결론적으로, MFFMS 기술은 생물학에서 양자 효과를 조사할 수 있는 독특한 기능을 제공합니다. 이 장비를 사용하면 레이저 출력과 광분해를 최소화할 수 있으므로 시험관 및 생체 내 실험에서 실제로 알려지지 않은 단백질-플라빈 결합 역학을 규명하는 데 매우 유용합니다. 추가 DLIA 분석을 통해 형광 이미지에서 MFE를 관찰하고 가짜 형광 신호를 제거하여 세포 환경 내에서 자성에 민감한 위치를 밝혀내는 데 유용한 도구를 제공합니다. Andor iXon Ultra 888 카메라는 생화학 반응에 대한 미세한 자기장 유도 양자 효과를 조사하는 데 적합한 검출기임이 입증되었습니다.

References

1. Antill et al., Nat. Photon. (2025), DOI: https://doi.org/10.1038/s41566-024-01593-x
2. Beardmore, Antill et al., Angew. Chem. Int. Ed., 54, 8494-8497 (2015), DOI: https://doi.org/10.1002/anie.201502591
3. Antill et al., Rev. Sci. Instrum., 89, 023707 (2018), DOI: https://doi.org/10.1063/1.5011693