이미지 분석을 통해 센트로솜 성숙을 더 잘 이해하는 연구자들

 

HeLa cells were synchronized by a double thymidine block and treated with DMSO vehicle (Control), emetine, harringtonine, or puromycin before anti-pericentrin (PCNT) immunostaining and PCNT smFISH. Representative confocal images and quantification of the PCNT mRNA distribution are shown for each condition. The researchers quantified the distribution of PCNT mRNA in cells by measuring the distance between 3D rendered PCNT smFISH signals and the center of the nearest centrosome. The fractions of mRNA as a function of distance to the nearest centrosome were then plotted as mean (solid lines) ±95% CI (shading) from three biological replicates. Note that PCNT mRNA moved away from the centrosome upon the harringtonine or puromycin treatment but stayed close to the centrosome upon the emetine treatment, similar to the control. Courtesy of Li-En Jao, University of California, Davis.

캘리포니아 대학교 데이비스의 리엔 자오가 이끄는 연구진은 세포가 분열하기 전에 중심소체 성숙이라는 과정을 통해 중심소체를 빠르게 확장하는 방법을 연구하고 있습니다. 이 과정이 제대로 작동하지 않으면 게놈이 불안정해지고 암에서 볼 수 있는 통제되지 않은 세포 분열로 이어질 수 있습니다. 연구팀은 Imaris 소프트웨어와 Andor Dragonfly 공초점 현미경 시스템을 사용하여 세포 분열 중에 센트로솜이 미세소관을 조직하는 방법에 대한 새로운 발견을 이루어냈습니다.

센트로솜은 세포막 없이 스스로 조립하는 미크론 크기의 소기관입니다. 세포 분열 전에 센트로좀은 “성숙”하여 미세소관 조직화 활동이 스핀들 미세소관의 조직화를 지원하는 데 필요한 최대치에 도달합니다.

새로운 연구를 위해 연구진은 다른 단백질의 모집을 도와 센트로좀 성숙을 시작하는 단백질 페리센트린에 초점을 맞췄습니다. 연구진은 세포가 어떻게 이 대량의 단백질을 단 몇 분 만에 대량으로 생산하여 센트로좀에 전달할 수 있는지에 대해 자세히 알아보고자 했습니다.

Detecting weak signals

연구진은 세포에서 페리센트린이 생성되는 방법과 위치에 대해 자세히 알아보기 위해 단일 분자 RNA 현장 혼성화(smFISH)와 항체 염색을 결합하여 페리센트린 RNA와 새로 합성된 페리센트린 단백질을 모두 검출했습니다. RNA와 새로 합성된 단백질의 공동 위치화를 통해 번역되는 정확한 RNA 분자가 밝혀졌습니다.

연구진은 마이크로렌즈 공초점 스캐너와 고감도 카메라가 통합된 회전식 디스크 공초점 현미경인 Andor Dragonfly 시스템을 사용하여 배양된 인간 세포의 페리센트린 RNA와 단백질을 이미지화했습니다. “드래곤플라이 시스템은 고감도 및 공초점 기능을 제공하여 약한 smFISH 신호를 감지할 수 있었습니다."라고 Jao는 말합니다. “또한 페리센트린 mRNA와 단백질을 모두 고감도와 해상도로 이미지화할 수 있었습니다.”

다음으로 연구진은 Imaris를 사용하여 단일 세포 수준에서 페리센트린 RNA 분자가 센트로솜과 관련하여 어떻게 분포되어 있는지를 정량화했습니다. 연구진은 Imaris를 사용하여 단백질 신호를 표면으로, mRNA 신호를 각 공초점 z-스택의 디컨볼루션 이미지에서 다양한 크기의 점으로 변환하여 세포 내 3차원 RNA 분포를 정량화하는 것으로 시작했습니다. 그런 다음 단백질 페리센트린 신호의 표면을 원본 이미지 위에 배치하고 Imaris의 통계 기능을 사용하여 적합 볼륨 내에서 원본 이미지의 강도 합을 구함으로써 센트로좀에서 페리센트린 단백질의 강도를 정량화했습니다.

Pericentrin is built and transported at once

전반적으로 이미지 분석 결과, 페리센트린 단백질은 유사 분열 중에 센트로솜으로 공동 번역되어 모집된다는 사실이 밝혀졌습니다. 즉, 세포는 RNA 분자를 템플릿으로 사용하여 단백질을 만들고 리보솜을 사용하여 구성 요소를 올바른 순서로 조립함으로써 페리센트린을 동시에 생성하고 운반합니다.

연구진은 잠자리 시스템과 Imaris를 사용하여 세포가 페리센트린의 센트로좀에 대한 공동 번역 표적화와 센트로좀 성숙 동안 다른 센트로좀 단백질의 모집을 어떻게 조정하는지 알아내기 위해 이 연구를 계속할 계획입니다.

The researchers used smFISH and double immunofluorescence (IF) to distinguish between newly synthesized and full-length pericentrin (PCNT) proteins (a). (b) Prometaphase HeLa cells received PCNT smFISH and anti-PCNT immunostaining against the N- and C-terminus of PCNT protein. Putative active translation sites were labeled by PCNT N-term IF and PCNT smFISH, but not by PCNT C-term IF (top panel). Upon the puromycin treatment, PCNT N-term IF signals were no longer colocalized with PCNT smFISH signals, indicating that those PCNT N-term IF signals on RNA represent nascent PCNT polypeptides. Orange boxes show higher contrast of areas labeled with dashed orange boxes. (c-d) Examples of rendering the PCNT protein and PCNT mRNA signals into “surface” and “spot”, respectively, from a confocal z-stack images using Imaris. (e) PCNT smFISH signals between 1 and 3 µm radius from the centrosome center were quantified for the presence of anti-PCNT N-term IF signals with or without a short puromycin treatment. Courtesy of Li-En Jao, University of California, Davis.

Research Paper: Sepulveda G, Antkowiak M, Brust-Mascher I, Mahe K, Ou T, Castro NM, Christensen LN, Cheung L, Jiang X, Yoon D, Huang B, Jao LE. 2018. Co-translational protein targeting facilitates centrosomal recruitment of PCNT during centrosome maturation in vertebrates. Elife. pii: e34959. doi: 10.7554/eLife.34959.